今日はディジェネレートPCRについてまとめたいと思います。
PCRについては以下の記事でまとめていますので、こちらも読んでもらえると嬉しいです。
生物の復習◇PCR Polymerase chain reaction◇原理◇倍々ゲーム - 理系サラリーマンの趣味と勉強
ディジェネレートPCRとは
ディジェネレートPCRとは、タンパク質のアミノ酸配列を元にプライマーを設計し、目的の遺伝子領域を増幅するPCRのことです。
原理は
遺伝子は3つの塩基で1つのアミノ酸をコードしています。アミノ酸がいくつも連なることで、機能を持ったタンパク質になります。逆に言えば、もし目的のタンパク質のアミノ酸配列が分かっている場合、遺伝子の配列もわかることとなります。
ただし、アミノ酸は複数の塩基の組み合わせを持っており、これを重複と言います。この縮重のために、１通りの塩基配列にまでは予測できません。
そこで、この縮重を計算に入れてプライマーを設計します。例えばフェニルアラニンの場合、UUU,UUCの２通りありますので、プライマーにはUUU・・・とUUC・・・の２通りのものを入れておくのです。これによって、未知領域でもタンパク質のアミノ酸配列を元に増幅することが可能となるのです。
用途は
ディジェネレートPCRは目的とする遺伝子の塩基配列が不明な場合に用いられる手法です。
また、対象とする生物に近縁な生物のタンパク質のアミノ酸配列を元に対象生物の遺伝子のクローニングを行いたい場合などに使用されます。
コツは
プライマーはおよそ20〜30塩基対程度ですので、7〜10アミノ酸分程度となります。アミノ酸によっては4種のコードがありますので、できるだけ、縮重が少ない領域で設計する必要があります。
また、アニーリング温度がPCRの温度条件の範囲内になるように気をつけながら設計することも必要です。
うまくいかないときはアニーリング温度を何パターンか試すのも良いと思います。
また、ディジェネレートPCRはその原理上完全に特異的な領域にプライマーを設計することにはなりません。
そこで、設計したプライマーの内側にさらにもう1組プライマーを設計し、外側のプライマーによるPCR、引き続きその内側のプライマーでPCRを行うことで、目的領域を増幅できる確率を上げます。
２組のプライマーをネステッドプライマーと言います。
ネステッドとは入れ子という意味です。
PCRにもさまざまな種類があります。基本原理は同じですので、目的によって関連付けて覚えていけると良いですね。
